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La pandemia de la COVID-19 continúa a nivel mundial y es necesario seguir la evolución de las variantes que surgen en cada nueva infección. En el laboratorio hemos puesto a punto la secuenciación ultra profunda a partir de hisopos nasofaríngeos positivos para SARS-CoV-2 que está documentando la enorme diversidad genética del virus y que nos está permitiendo alcanzar niveles de detección de mutantes no alcanzables por las técnicas que se limitan a identificar las secuencias mayoritarias. Hemos podido detectar en espectros de mutantes, sustituciones tanto en pacientes no vacunados como en casos de fallos de vacunación, que posteriormente se imponen en variantes de preocupación. Por ejemplo, hemos descrito una sustitución de aminoácido típica de la variante Omicron meses antes de que pasase a ser dominante epidemiológicamente. En este proyecto queremos cambiar el paradigma establecido de cómo se analiza la composición genética de los virus, su representación en bases de datos y establecer terapias de combinación efectivas que consideren la gran variabilidad del SARS-CoV-2. Para ello se plantean los siguientes objetivos: 1) Análisis de muestras representativas de las 6 olas pandémicas de la COVID-19 en la Comunidad de Madrid (CM) y ampliación a posibles futuras olas. El RNA de los virus aislados de pacientes se caracterizará por secuenciación masiva para cuantificar la complejidad de los espectros de mutantes y relacionarla con la severidad de la infección, parámetros clínicos de los pacientes y capacidad de replicación de los aislados en cultivos celulares. A partir de los datos obtenidos se seleccionarán virus con fenotipos extremos de severidad de infección y capacidad replicativa para los ensayos con antivirales; 2) Caracterización mediante redes neuronales auto-organizadas de los cambios evolutivos del virus desde el inicio de la pandemia hasta la actualidad. Los datos de secuenciación masiva se utilizarán para visualizar las trayectorias evolutivas del virus en el tiempo en forma de mapas de fitness; 3) Implementación de la primera base de datos de secuencias basada en nubes o espectros de mutantes de un virus RNA. Las bases de datos actuales sólo consideran secuencias consenso o secuencias mayoritarias, pero no tienen en cuenta las mutaciones a frecuencias bajas que pueden ser responsables de fallos terapéuticos y que, además, forman parte son los potenciales variantes de preocupación futuros. Esta nueva modalidad de base de datos podrá definir posiciones totalmente o altamente conservadas frente a las que dirigir agentes antivirales o diseños vacunales; 4) Establecimiento de terapias de combinación sinérgicas frente a aislados clínicos de alto fitness en cultivo celular. Se utilizarán virus de las 6 (y posibles futuras) olas pandémicas con distinta capacidad replicativa o fitness en cultivo celular. Se ensayarán terapias de combinación basadas en péptidos inhibidores de la entrada del virus y de las interfaces de unión de los complejos nsp10-nsp14 y nsp-10-nsp16 e inhibidores de la polimerasa vírica como son el favipiravir (FPV), la ribavirina (RBV), el remdesivir (RDV), y la β-D-N4-hydroxycytidina (NHC, molnupiravir). RDV, FPV y NHC han mostrado actividad inhibitoria de SARS-CoV-2; los dos últimos análogos de nucleósido actúan, al menos en parte, mediante mutagénesis letal. Este proyecto es factible al disponer de: (i) 6.000 aislados clínicos de las 6 olas pandémicas provenientes de enfermos de la CM, bien catalogados por carga viral e historia clínica de los pacientes; (ii) la base experimental y bioinformática de la secuenciación masiva y de ordenación de haplotipos (iii) el sistema de infección de cultivos celulares por SARS-CoV-2 en el laboratorio de alta seguridad BSL-3 (P-3). El 70% de los aislados han infectado células en cultivo, lo que está permitiendo obtener poblaciones bien caracterizadas para el ensayo de agentes antivíricos. Dada la diversidad de conocimientos y el amplio abanico de metodologías implicadas el proyecto tiene un carácter marcadamente interdisciplinar y un potencial de gran impacto.
Palabras clave: SARS-CoV-2; redes neuronales auto-organizadas; terapias antivirales